Essai clinique Transplantation de microbiote fécale pour traitement S.L.A. - investigations Dr Jessica Mandrioli & Autres - ITALIE - à suivre...

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Cette piste s’appelle la Transplantation de Microbiote Fécal (T.M.F.).
Contexte et justifications : Parmi les acteurs clés de la pathogenèse de la sclérose latérale amyotrophique (S.L.A. ), la microglie et les lymphocytes T régulateurs (Treg) sont des cellules candidates pour modifier l'évolution de la maladie. Le microbiote intestinal (GM) agit en façonnant la tolérance immunitaire et en régulant le nombre de Treg et la fonction suppressive, en plus des neuropeptides circulants et d'autres cellules immunitaires qui jouent de concert à travers l'axe intestin-cerveau. Des modèles murins antérieurs ont montré une flore entérique modifiée au stade précoce de la S.L.A.,  indiquant un rôle possible du GM dans la pathogenèse de la S.L.A. . La transplantation microbienne fécale (T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL)) est une intervention thérapeutique bien connue utilisée pour rétablir le microenvironnement approprié et moduler l'immunité entérique et systémique. Méthodes : Nous allons réaliser un essai clinique multicentrique randomisé en double aveugle utilisant la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) comme intervention thérapeutique pour les patients S.L.A.  (NCT0376632). Quarante-deux patients S.L.A.,  à un stade précoce, seront recrutés avec un ratio d'attribution de 2 : 1 (28 patients traités par TMF vs 14 témoins). La durée de l'étude sera de 12 mois par patient. Trois procédures endoscopiques pour les biopsies intestinales dans les groupes T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) et témoins sont prévues au départ, au 6ième mois et au 12^ième mois ; au départ et au 6^ième mois 6, des matières fécales fraîches provenant de donneurs sains seront perfusées chez les patients par les groupes d'intervention. Le résultat principal est un changement significatif du nombre de Treg entre les patients traités par T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) et le groupe témoin de la ligne de base au 6^ième mois. Les critères de jugement secondaires incluent des objectifs biologiques spécifiques, impliquant une analyse approfondie des cellules immunitaires et des changements d'état inflammatoire, des biomarqueurs centraux et périphériques de la S.L.A.  , outre une analyse complète du microbiote intestinal, salivaire et fécal. D'autres objectifs secondaires comprennent les résultats cliniques validés de la S.L.A.  (Survie, capacité vitale forcée et modifications de l'ALSFRS-R), en plus de la sécurité et de la qualité de vie.
Résultats attendus : Nous attendons que la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) augmente le nombre de Treg et la fonctionnalité suppressive, faisant passer le système immunitaire entourant les motoneurones à un statut anti-inflammatoire et neuroprotecteur. Une analyse approfondie des populations de cellules immunitaires, des niveaux de cytokines et du microbiote (intestin, fécal et salive) permettra de faire la lumière sur les processus précoces pouvant conduire à l'évolution dégénérative de la S.L.A. .
Les cytokines (du grec cyto, cellule, et kinos, mouvement) sont un ensemble hétérogène de protéines ou des glycoprotéines solubles (masse moléculaire moyenne de 8 à 50 kDa).
Conclusions : Il s'agit du premier essai avec la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) en tant qu'intervention potentielle pour modifier la réponse immunologique à la S.L.A.  et la progression de la maladie à un stade précoce. Introduction : Lorsqu'on se demande pourquoi tant d'échecs dans les essais cliniques dans la sclérose latérale amyotrophique (S.L.A. ), le manque de compréhension complète des systèmes pathogènes à l'origine de l'apparition et de la progression de la maladie pourrait être considéré comme l'une des principales raisons. En effet, la S.L.A.  est un syndrome complexe. Les voies cellulaires aberrantes se traduisent par un mauvais repliement des protéines, avec un stress du réticulum endoplasmique, une autophagie défectueuse et des dommages au cytosquelette (1), associés à un traitement de l'ARN échelonné et à l'homéostasie des mitochondries, un stress oxydatif accru, une accrue, une réduction de la subsistance neurotrophique et une réponse inflammatoire gliale qui est orienté vers un côté nuisible (2).
·        L'excitotoxicité est une transmission excessive du neurotransmetteur glutamate qui a des effets toxiques sur les neurones récepteurs du signal dans le système nerveux central (cerveau et moelle épinière).
Des études récentes ont mis en évidence le rôle de la microglie et ouvert de nouvelles perspectives dans la connaissance des mécanismes moléculaires autonomes non cellulaires pouvant contribuer à la S.L.A., en les lançant comme une cible plausible pour de nombreux essais cliniques. Au cours de la progression de la S.L.A., la microglie activée passe du phénotype M2, qui est neuroprotecteur et soutient la réparation tissulaire et la survie des neurones par la libération de facteurs neuroprotecteurs, au phénotype M1, qui est toxique et contribue à la mort neuronale par la production de cytokines pro-inflammatoires, et les tissus destruction. Les approches thérapeutiques ciblant la polarisation de la microglie pour induire le phénotype M2 sont des stratégies prometteuses pour contenir la neurodégénérescence locale et améliorer les résultats de la S.L.A.  (3). En effet, dans les modèles animaux de la maladie, la diminution des niveaux mutants de microglie a fortement ralenti la progression ultérieure de la maladie (4).
·        La microglie (ou microgliocytes), une population de cellules gliales, est un macrophage que l'on retrouve dans le système nerveux central (cerveau, moelle épinière et rétine) 1, formant ainsi la principale défense immunitaire active du système nerveux central.
Il a été démontré que le commutateur phénotypique des macrophages M1 / ​​M2 est induit par les cellules T CD4 +, en particulier les cellules régulatrices CD4 + CD25 + Foxp3 + T (Treg) (5, 6). Dans le sang et la moelle épinière des patients atteints de S.L.A., les lymphocytes T CD4 + (T helper-Th) sont augmentés, en particulier avec un phénotype Th1 / Th17 à prédominance pro-inflammatoire (7). Au contraire, les Treg du sang de patients S.L.A.  ont démontré une diminution significative de la capacité à supprimer la prolifération des lymphocytes T effecteurs ; et à noter, l'ampleur de la perte de suppression était corrélée à la progression de la maladie (7). Le transfert passif des Treg mSOD1 dans des souris S.L.A.  dépourvues de lymphocytes T fonctionnels a prolongé leur survie tandis que l'ARNm de FoxP3 dans la moelle épinière des souris mSOD1 était inversement corrélé à la progression de la maladie (. Enfin, chez les patients atteints de S.L.A.,  le nombre et le pourcentage de Treg et l'expression de FoxP3 diminuaient avec une progression plus rapide de la maladie et étaient des prédicteurs précoces de la progression et de la survie de la S.L.A.  (8, 9).
Très récemment, des perfusions autologues de cellules Treg expansées et d'IL-2 concomitante chez des patients atteints de S.L.A.  se sont avérées sûres et tolérables aux stades précoces et ultérieurs de la maladie dans une étude de phase I, où les perfusions semblaient ralentir les taux de progression (10). De plus, l'étude a détecté une corrélation entre la fonction suppressive du Treg et la progression de la maladie, soulignant la justification sous-jacente à l'utilisation de la fonctionnalité suppressive du Treg comme indicateur de l'état clinique (10).
Toutes ces preuves indiquent un dysfonctionnement de la réponse immunitaire adaptative pendant la S.L.A. De plus en plus de données suggèrent que la réponse immunitaire systémique et en particulier le système neuro-immunitaire peut être modulée par le microbiote intestinal (GM) via l'axe intestin-cerveau, un acteur clé dans la régulation de la signalisation mutuelle entre la microflore intestinale et le système nerveux central (SNC) (11-12) utilisant la communication bidirectionnelle via une signalisation neuronale, hormonale, immunologique et toxique (13-15).
Le microbiote intestinal comprend un écosystème complexe avec une densité et une diversité bactérienne exceptionnellement élevées : le tube digestif adulte contient 1–2 kg de cellules microbiennes de cent espèces bactériennes, dont plus de 80% n'ont pas été cultivées (16–18).
Le GM communique directement avec le système immunitaire entérique, façonnant la tolérance immunitaire et contribuant ainsi à la modulation des réactions immunitaires pendant l'inflammation (19). Inversement, lors de l'invasion d'agents pathogènes, de la dysbiose ou de la rupture de la barrière, les modèles moléculaires associés aux microbes stimulent les macrophages et les cellules dendritiques pour produire des cytokines pro-inflammatoires. À leur tour, la cytokine active les cellules immunitaires adaptatives, contribuant ainsi à la dégradation de l'homéostasie immunitaire (20), et détermine généralement la perte des cellules immunitaires qui contrôlent l'agressivité du système immunitaire, à savoir les Treg (12).
Plusieurs processus biologiques du cerveau peuvent être influencés par des altérations GM. On a constaté que les souris exemptes de germes avaient une densité, une morphologie et une maturité de la microglie modifiées, et le traitement avec un mélange d'acides gras à chaîne courte (AGCC) a restauré la densité et la morphologie des cellules immunitaires du SNC, ce qui suggère que le GM peut influencer à la fois le développement et les fonctions de la microglie (12, 21).
Dans la S.L.A.,  la dysbiose génétiquement modifiée peut faciliter l'apparition de la maladie ou entraîner sa progression et les résultats associés, en présence d'autres facteurs de risque. Alternativement, la dysbiose GM peut être (davantage) modifiée par la présence de la maladie et, chez certains individus, contribuer à la progression de la maladie, au pronostic, également en termes de réponse variable aux traitements médicamenteux (22).
Une altération de la flore bactérienne intestinale comme déclencheur externe pourrait expliquer les rares cas de S.L.A.  chez les conjoints ou dans certaines grappes (23).
Sur la base de ces prémisses, le traitement de la dysbiose génétiquement modifiée par la restauration du microbiote aurait le potentiel d'interférer et de ralentir la progression de la S.L.A.  (24).
Notre essai vise à évaluer la base biologique d'un traitement potentiel de la S.L.A.  (à savoir la transplantation de microbiote fécal, T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL)) afin de planifier une étude d'efficacité ultérieure.
L'objectif principal est d'évaluer si la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) augmente le nombre de Tregs chez les patients S.L.A., traités par T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) par rapport au bras témoin et mesurés au départ et au 6^ième mois.
Les objectifs secondaires comprennent des objectifs biologiques spécifiques: (i) comparaison entre les patients traités et le bras (l’équipe) témoin du nombre de Treg et des sous-ensembles de cellules T à différents moments dans des échantillons de sang et de tissus intestinaux; (ii) comparaison entre les patients traités et le groupe témoin des neurofilaments et des cytokines et cellules du LCR; (iii) analyse d'échantillons fécaux et salivaires entre les deux groupes pour évaluer le profil du microbiote et des cytokines ; (iv) l'innocuité et la tolérabilité de la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) dans la S.L.A. ; (v) évaluation clinique (y compris survie sans trachéotomie, score de capacité vitale forcée, score ALSFRS-R, fréquence de PEG ou VNI); enfin, (vi) l'évaluation de la qualité de vie (QoL).
Méthodes et analyse
Étudier le design
Nous allons réaliser une étude multicentrique randomisée en double aveugle sur la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) dans la S.L.A.
·        Rajout Définition de « randomiser » : introduction d’un élément aléatoire dans un calcul ou dans un raisonnement.
·        L'attribution dans un groupe se fait de façon aléatoire par tirage au sort (randomisation)
·        La répartition des groupes se fait à l'insu des participants (étude en aveugle) et éventuellement des cliniciens (double aveugle). Une étude randomisée permet ainsi d'établir formellement un lien de causalité, sous réserve qu'aucune source de biais secondaire n’ait été introduite en cours d'essai (comme par exemple des procédures de suivi différentes dans les deux groupes). Sans groupe témoin, l'effet du traitement se composera de l'effet intrinsèque du médicament additionné de l’effet placebo.
 
La figure 1 résume la conception de l'étude.
FIGURE 1 Voir sur le lien.
Figure 1. Image de la conception de l'étude.
L'étude comprendra 42 patients S.L.A.  avec une répartition 2 : 1 dans 2 groupes de sujets (28 T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) vs 14 témoins). Les patients seront examinés dans les 15 jours précédant le départ ; puis ils seront alloués aléatoirement à la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) ou au groupe témoin. La randomisation sera 2 : 1 (T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) : contrôles) et sera effectuée en ligne (en utilisant une liste de nombres aléatoires générée par ordinateur qui sera générée de manière centralisée dans l'unité statistique). Compte tenu de la progression hétérogène de la S.L.A., les patients seront stratifiés par ΔFS (taux de progression), calculé lors de la randomisation selon Kimura et al. (25). Le riluzole sera maintenu pendant toute la durée de l'étude à moins d'événements indésirables ou de décision des patients de se retirer. Le traitement endoscopique sera effectué dans les 21 jours suivant la randomisation. Le numéro de randomisation ne sera en aucun cas réutilisé. Le temps d'inscription estimé est de 18 mois. Population d'étude : L'étude comprendra une S.L.A.  probable soutenue en laboratoire, cliniquement probable ou définitive selon les critères révisés d'El Escorial (sporadique et familier). Les critères d'inclusion et d'exclusion pour le recrutement des patients sont présentés dans le tableau 1.
TABLEAU 1
Tableau 1. Critères d'inclusion et d'exclusion des patients.
Méthodes d'intervention. Le traitement sera en double aveugle pour les patients et les neurologues, mais pas pour l'endo copiste et le microbiologiste. Les patients S.L.A.  subiront une endoscopie gastro-intestinale supérieure avec biopsies de l'intestin grêle (n ° 4 biopsies de l'intestin grêle, réalisées avec une force de biopsie standard) au départ et après 6 et 12 mois. Au départ, les patients seront randomisés (2 : 1) soit pour une perfusion allogénique (de donneurs) de matières fécales collectées (60 grammes) (T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL)) dans le duodénum-jéjunum, soit sans traitement (groupe témoin). La perfusion sera réalisée à travers une sonde naso-jéjunale standard qui sera placée pendant l'endoscopie. La perfusion fécale sera répétée au 6^ième mois. Les patients du groupe témoin ne recevront aucun traitement (au départ ou au 6^ième mois), mais resteront aveugles au traitement en raison de la sédation due aux biopsies de l'intestin grêle. Le microbiome fécal sera dilué dans une solution saline (200 ml) et perfusé à une vitesse de 30 ml min (quantité totale de la performance : 15 min.). Les matières fécales fraîches pour la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) seront obtenues par des donneurs habituels en bonne santé, pour une infection à Clostridium difficile. Le tableau 2 présente les analyses de sang et de selles pour les donneurs et les critères de sélection généraux. Avant la préparation, le don d'échantillons sera toujours analysé par un test moléculaire rapide pour détecter les agents pathogènes intestinaux.
Tableau 2. Critères de sélection des donateurs. L'analyse des sous-populations de cellules T sera réalisée à la fois dans le sang périphérique et dans la muqueuse intestinale : cellules Treg, Th17, effectrices et cellules mémoire centrales. À la fin de la période de traitement, 6 mois supplémentaires seront nécessaires comme période de suivi. Cette période est destinée à évaluer les événements indésirables tardifs (EI) et les effets biologiques ou cliniques ultérieurs de la transplantation. Estimation de la taille de l'échantillon. La taille de l'échantillon a été calculée en considérant comme critère de jugement principal la proportion de patients, dans le groupe de transplantation par rapport aux témoins, affichant une « réponse positive » destinée à augmenter la proportion de Treg d'au moins 20%. L'hypothèse nulle indique que la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) n'améliore pas significativement la proportion de réponses positives chez les patients traités après le deuxième tour de T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL), par rapport à leur ligne de base et au groupe témoin. L'hypothèse alternative est que la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) donne une proportion de réponses positives chez au moins 50% des patients traités par rapport à un maximum de 5% de réponses positives chez les patients du groupe témoin. L'étude a été conçue pour refuser l'hypothèse nulle avec une erreur alpha de 0,05 et une puissance de 0,80 selon des méthodes statistiques publiées antérieurement (26) et à des niveaux connus de Tregs chez les patients S.L.A., qui affichent généralement une légère réduction de Treg% (moyenne ± écart-type : 2,1 ± 0,7) par rapport aux témoins sains avec des patients à progression rapide ayant en moyenne 31% de Treg en moins (8, 27).
A cet effet, une population de 39 patients randomisés dans deux groupes de traitement suffirait ; compte tenu d'un abandon moyen de 10%, un recrutement de 42 patients sera nécessaire. Mesures des résultats. Le critère de jugement principal est la modification de la valeur initiale au 6^ième mois du nombre de Treg chez les patients atteints de S.L.A.  transplantés par rapport au groupe témoin (26).
Les mesures des résultats secondaires comprennent les éléments suivants : ✓ Mesures des résultats biologiques : Changement de la ligne de base aux 3ième, 6ième, 9ième, 12^ième mois de la distribution des lymphocytes T, en particulier le rapport Treg / Th1 ou Treg / Th17 comparant le groupe T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) et le groupe témoin (à la fois - sang - à chaque point dans le temps, et l'intestin grêle - seulement au 6ième et 12^ième mois).
- Changements de l'état de base aux mois 3ième, 6ième, 9ième, 12^ième mois de l'état inflammatoire (profil cytokine) en comparant la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) et le groupe témoin (dans le sang et les selles à chaque instant, et dans le LCR au 6^ième mois).
- Changements de la ligne de base aux 3ième, 6ième, 9ième, 12^ième mois entre le groupe T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) et le groupe contrôle dans les biomarqueurs suivants : créatinine, albumine, CK, vitamine D, protéine des chaînes lourdes / légères du neurofilament plasma / LCR. - Modifications biologiques de l'inclusion aux 6^ième mois et 12^ième mois dans la composition de la salive, de l'intestin et du microbiote fécal (y compris les AGCC) comparant la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) et le groupe témoin. ✓ Sécurité : sera évaluée dans la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) et le groupe témoin en tenant compte de la survenue d'E.I. et des modifications de l'examen physique, des signes vitaux, du poids corporel et des tests de laboratoire (biochimie, hématologie) pendant et après le traitement.
✓ Mesures des résultats cliniques :
Les variables cliniques suivantes seront comparées entre la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) et le groupe témoin :
- Changement de la ligne de base à chaque point temporel (1er, 3ième, 6ième, 9ième, 12^ième mois) de ALSFRS-R.
- Survie depuis l'apparition et la randomisation jusqu'à la mort ou à la trachéotomie.
- Changement de la capacité vitale forcée (CVF) de la ligne de base à chaque point temporel (1er, 3ième, 6ième, 9ième, 12^ième mois).
- Fréquence des procédures (PEG, VNI, IV) de la ligne de base au 3ième, 6ième, 9ième, 12^ième mois.
✓ Qualité de vie : sera évaluée comme la variation des valeurs absolues et relatives du questionnaire d'évaluation spécifique de la sclérose latérale amyotrophique (ALSAQ40) de la ligne de base aux 6ième et 12^ième mois dans la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) et le groupe témoin. Le tableau 3 montre l'organigramme de l'étude.TABLEAU 3 - Tableau 3. Organigramme de l'étude. Événements indésirables et sécurité. Selon la directive 2004/23 / CE (mise en œuvre en Italie avec D. Lgs 191/2007) : - «Evénement indésirable grave» (EIG) désigne tout événement indésirable associé à l'obtention, au test, au traitement, au stockage et à la distribution de tissus et de cellules pouvant entraîner la transmission d'une maladie transmissible, mortelle ou mettant la vie en danger, invalidante, ou des conditions incapacitantes pour les patients ou qui pourraient entraîner ou prolonger une hospitalisation ou une morbidité (https://www.hta.gov.uk/policies/human-application-adverse-event-and-reaction-saears-reporting; http : http://www.sc-toolkit.ac.uk/displaycontent.cfm? widCall1 = customWidgets.content_view_1 & cit_id = 84).
- «Réaction indésirable grave» (SAR) signifie une réponse non intentionnelle, y compris une maladie transmissible, chez le donneur ou chez le receveur associée à l'obtention ou à l'application humaine de tissus et de cellules qui est mortelle, mettant la vie en danger, invalidante, invalidante ou qui entraîne ou prolonge l'hospitalisation ou la morbidité (https://www.hta.gov.uk/policies/human-application-adverse-event-and-reaction-saears-reporting; http: http://www.sc-toolkit .ac.uk / displaycontent.cfm? widCall1 = customWidgets.content_view_1 & cit_id = 84).
Les études existantes suggèrent que la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) est une thérapie sûre, avec peu d'événements indésirables graves signalés. Des cas individuels de neuropathie périphérique, de syndrome de Sjögren, de purpura thrombopénique idiopathique, de colite microscopique, de dermatite de contact, de polyarthrite rhumatoïde, d'obésité, de bactériémie et de poussée de colite ulcéreuse après T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) ont été signalés (24). Dans une méta-analyse, le taux d'incidence global des événements indésirables après T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) était de 28,5%. L'événement indésirable le plus courant attribuable à la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) était l'inconfort abdominal ; la diarrhée, la fièvre passagère, les nausées, les vomissements et la constipation étaient également d'autres symptômes courants associés à la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) (24, 28–31). Pour ces effets indésirables bénins, les investigateurs traiteront les symptômes selon la pratique clinique habituelle. En cas de symptômes pouvant être considérés comme graves ou mettant la vie en danger, l'investigateur devra en informer immédiatement le promoteur (dans les 24 h par fax en utilisant un formulaire SAE) et un deuxième cycle de T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) peut être évité selon le jugement de l'investigateur local. Conformément aux exigences législatives la S.L.A., les centres seront priés de signaler immédiatement à partir de leur connaissance tout SAE ou SAR survenu pendant l'essai et le centre de coordination enverra les formulaires remplis par courrier électronique au Centre national italien de transplantation (CNT). Le centre de coordination sera responsable de la notification appropriée des EI aux autorités de régulation (CNT) tous les 6 mois ; les enquêteurs auront la responsabilité de faire un rapport au comité d'éthique approprié. En cas de décès, un rapport clinique sera préparé par l'investigateur concerné, avec le formulaire SAE ; en cas d'autopsie, un rapport d'autopsie sera ajouté à la documentation de l'étude. L'essai sera arrêté, en cas de 30% d’excès d’évènements notifiés auprès du groupe traitant les événements (incidences) indésirables : suivants : péritonite, hémorragie gastro-intestinale haute, septicémie, bactériémie. Au lieu de cela, les prochaines toxicités seront considérées comme acceptables : diarrhée, crampes et douleurs abdominales, nausées, vomissements, flatulences, fièvre, constipation, étourdissements, maux de gorge, rhinorrhée, ballonnements, étouffement nasal, infections urinaires, maux de tête, altérations légères / modérées des cellules sanguines ; CRP élevée, éruptions cutanées, urticaire, dermatoses, dermatite (gravité légère/modérée), élévation des aminotransférases/phosphatases alcalines, perte d'appétit, colite/gastro-entérite. Enregistrement des données et surveillance des données. Un formulaire de rapport de cas électronique (CRF) sera préparé pour l'enregistrement des données. Un organisme de recherche sous contrat (CRO) certifié sera en charge du suivi de l'étude. Le moniteur d'étude indiqué par le centre de coordination sera en contact avec les enquêteurs et effectuera une visite dans chaque centre pour discuter et / ou collecter des données. Le contrôleur effectuera une visite avant le début de l'étude pour discuter du protocole et des obligations des enquêteurs et du promoteur. Les enquêteurs de chaque centre sont tenus de permettre au Contrôleur d'effectuer la visite du site, la visite de fin d'étude et la visite de fermeture du site. Les enquêteurs rendront disponibles tous les dossiers pertinents, y compris les documents médicaux originaux, pour permettre l’inspection par les autorités réglementaires. Des copies du protocole, des codes d'identification du sujet, du formulaire de rapport électronique de cas, des données sources, du formulaire de consentement éclairé et d'autres documents liés à la conduite de l'étude et à l'appui des données collectées auprès de chaque sujet seront stockées pendant la durée maximale requise par l'étude. Aucun document d'étude ne doit être détruit. Les originaux de toute la documentation et des copies de la correspondance sortante concernant l'étude seront stockés et conservés par le commanditaire dans un endroit sûr dans le fichier principal de l'essai. Rôle des centres participants. Cette étude multicentrique impliquera neuf unités italiennes : six centres de référence S.L.A.  - ALS (situés à Florence, Chieti, Pérouse, Modène et Rome), trois laboratoires renommés, un service d'endoscopie et une unité statistique. La S.L.A.  est une maladie rare à progression rapide et sans traitement efficace, qui nécessite une solide approche méthodologique, clinique et biologique pour la conduite des essais cliniques. Chaque centre clinique doit : (I) randomiser au moins sept patients selon des critères d'inclusion et d'exclusion dès 18 mois ; (II) fournir un chercheur principal pour évaluer les critères d'inclusion et d'exclusion et évaluer les résultats primaires et secondaires ; (III) adhérer aux directives de gestion de la S.L.A.  de la Fédération européenne des sociétés de neurologie (en particulier en ce qui concerne les problèmes de ventilation et de nutrition). L'analyse des biomarqueurs sera centralisée et réalisée dans deux laboratoires de renommée internationale Laboratoire de microbiologie Policlinico Gemelli à Rome et Laboratoire d'immunologie, Département de médecine expérimentale et clinique - Université de Florence, et T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) sera réalisée au Policlinico Gemelli à Rome, un Centre européen pour ce type de traitement. L'analyse des données. Les données seront collectées par les enquêteurs via le CRF électronique, qui seront transmises à la base de données des essais. À la fin de l'essai, les données de la base de données verrouillée seront extraites pour analyse par un statisticien expert. Des analyses séparées seront effectuées dans : 1. Tous les sujets randomisés recevant au moins 1 T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) (population en intention de traiter).
2. Tous les sujets randomisés à l'exclusion des écarts de protocole (population par protocole).
En ce qui concerne l'activité biologique, la réponse immunitaire à la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) sera analysée comme une différence de réponse positive à la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) entre le groupe témoin et le groupe T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL), évaluée par comparaison de la proportion de patients dans les deux groupes présentant une augmentation moyenne des Tregs d'au moins 20%, entre les mesures de base et le 6^ième mois.
Les valeurs moyennes de différentes sous-populations de cellules T, B, NK, de biomarqueurs de neurodégénérescence et de cytokines seront évaluées et les différences moyennes de concentrations plasmatiques entre les deux groupes de traitement seront calculées à l'aide du test t ou du test de Wilcoxon-Mann-Whitney comme indiqué précédemment (26). L'ANOVA sera utilisée pour évaluer le changement moyen au fil du temps pour les mêmes variables que ci-dessus, avec le traitement comme facteur inter-sujets et le temps comme facteur intra-sujets. Différents modèles seront utilisés, chacun avec un biomarqueur d'activité différent comme variable dépendante. Les modèles seront ajustés pour toute distribution déséquilibrée des principaux facteurs pronostiques (par exemple l'âge) entre les deux groupes de traitement, selon des méthodes statistiques publiées antérieurement (26). L'analyse du microbiote sera réalisée avec un logiciel spécifique. Un enregistrement de tout AE et SAE sera conservé pour chaque sujet recevant au moins un cycle de T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) jusqu'à la fin de l'étude, en effectuant une analyse de sécurité en conséquence. En ce qui concerne les mesures des résultats cliniques, nous comparerons les changements du score total et des sous-scores de l'ALSFRS-R (bulbaire, respiratoire, macroscopique et motricité fine) de la ligne de base à chaque moment dans le groupe de traitement par rapport au groupe témoin. La fréquence des procédures (PEG, VNI, IV) sera comparée de la ligne de base à chaque moment dans le traitement par rapport au groupe témoin. La comparaison des critères cliniques entre les groupes sera réalisée en utilisant le modèle de régression logistique. Les résultats seront présentés sous forme de rapports de cotes (OR) et de 95% IC. T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) sera considéré comme eff. OR) et 95% C.I. La T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) sera considérée comme efficace en ce qui concerne les contrôles si le OU des résultats positifs fournira un p <0,05. L'évolution de la CVF au cours de l'étude sera analysée à l'aide d'un modèle mixte pour mesures répétées (MMRM). La différence entre les groupes de traitement et l'IC bilatéral à 95% sera estimée. Des tests de log-rank via la méthode Kaplan-Meier seront utilisés pour comparer les différences de survie sans trachéotomie entre les deux groupes de traitement (du début et de la randomisation), tandis que Cox Un modèle de risque proportionnel sera utilisé pour ajuster les éventuels facteurs pronostiques déséquilibrés. La signification statistique sera fixée à 0,05 pour un test bilatéral. La dernière observation sera prise en compte pour les patients avec des données manquantes.
Compte tenu de la courte durée de l'étude, une analyse intermédiaire des données d'efficacité n'est pas prévue. Néanmoins, pour répondre aux préoccupations en matière de sécurité, un rapport contenant toutes les données cliniques pertinentes des patients sera envoyé par l'unité des statistiques à un comité de surveillance indépendant des données et de la sécurité pour les réunions prévues du DSMB (également via Skype) lorsque 14 patients auront terminé le deuxième traitement et puis tous les 6 mois.
Approbation éthique
Cette étude a été approuvée par Comitato Etico Area Vasta Emilia Nord en juillet 2018 (prot.n.0010722/18) et par le Centre national de transplantation le 29 mars 2019.
Les essais ont été enregistrés dans Clinicaltrials.gov (NCT03766321).
Discussion
Choix du traitement
La T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) remonte à la Chine du quatrième siècle, comme l’indique un rapport d'un médecin de médecine traditionnelle chinoise décrivant le rétablissement d'un patient d'une intoxication alimentaire et d'une diarrhée grave après un traitement avec une suspension fécale humaine orale (32). D'autres utilisations de ce type de traitement ont été décrites depuis le XVIe siècle (32–35) principalement par lavement de rétention.
Plus récemment, la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) est apparue comme un traitement sûr et efficace pour la prise en charge des infections récurrentes et éventuellement réfractaires à Clostridium Difficile (ICD) en restaurant la diversité microbienne intestinale, avec des taux de guérison> 85% (36). Actuellement, la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) a été approuvée pour le traitement de cette affection, pour laquelle elle a obtenu à l'unanimité d'excellents résultats (24, 37, 38).
Puisqu'un microbiote perturbé est associé à plusieurs maladies, il est concevable que les thérapies de restauration du microbiote puissent être utiles dans leur prise en charge (24). L'importance d'un microbiome intestinal « sain » a été démontrée en oncologie, et en détail en relation avec la réponse au traitement antitumoral (39–41). En outre, quelques articles ont récemment mis en évidence un lien potentiel entre la dysbiose intestinale et les maladies neurologiques (41–45), telles que la sclérose en plaques (46, 47), la maladie de Parkinson (48, 49) et la maladie d'Alzheimer (50, 51) . Pour cette raison, des études testent actuellement le potentiel de la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) pour traiter la sclérose en plaques, la myasthénie grave, la maladie de Parkinson et l'épilepsie (22, 52). Certaines données préliminaires placent la base théorique d'une implication du GM dans la S.L.A. parce que le système immunitaire, qui joue un rôle clé au moins dans la progression de la S.L.A.,  peut être modulé par l'axe intestin-cerveau. En effet, l'environnement intestinal favorise la génération de lymphocytes T auto réactifs avec des fonctions de régulation uniques, importantes pour prévenir l'auto-immunité du SNC (53). Certaines bactéries commensales peuvent induire le développement des Tregs et la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBI TE FÉCAL) détermine l'augmentation des Tregs (54).
De plus, des modifications de la composition des OGM dans la S.L.A.  ont été signalées dans des études antérieures. Fang et coll. (55) ont trouvé une population significativement accrue de micro-organismes nuisibles (genre Dorea) avec une population réduite de micro-organismes bénéfiques (genre Oscillibacter, Anaerostipes, Lachnospiraceae) chez les patients S.L.A.  (45). Les auteurs ont suggéré que le déséquilibre dans la constitution de la microflore intestinale peut provoquer une dysbiose pro-inflammatoire qui peut altérer la barrière épithéliale intestinale, favorisant des réponses immunitaires / inflammatoires avec un rôle majeur dans la pathogenèse de la S.L.A.
Une autre étude (56) a détecté une quantité plus élevée d'E. Coli et d'entérobactéries et une faible présence de levure totale dans la composition GM des patients S.L.A.  par rapport aux témoins sains.
Deux recherches précliniques, réalisées sur des animaux G93A, ont étudié la corrélation entre la dysbiose intestinale, la perméabilité intestinale modifiée et les réponses inflammatoires / neurogènes entériques (12). Wu et coll. (57) ont trouvé des signes d'intestin fuyant chez une souris transgénique G93A ayant une perméabilité intestinale augmentée en raison d'une altération de la structure de la jonction intestinale serrée et de l'expression des protéines associées, par rapport aux souris de type sauvage (57). Le même modèle a montré un nombre réduit et une fonction altérée des cellules épithéliales Paneth, qui ont un impact sur le GM et ont un rôle dans la réponse immunitaire innée, et, en ce qui concerne la composition GM, une plus faible abondance de bactéries productrices de butyrate telles que Butyrivibrio fibrisolvens, Escherichia coli et Firmicutes a été détecté. Enfin, les changements dans le microbiome intestinal inclus. De même, Zhang et al. (58) ont rapporté une corrélation entre la dysbiose intestinale et les altérations morpho fonctionnelles de la perméabilité intestinale dans le même modèle, depuis les premiers stades de la maladie. Ils ont mis en évidence la présence d'agrégats SOD1, caractéristiques de la S.L.A. associée aux mutations SOD1 chez des modèles animaux et chez des patients, non seulement dans les neurones et le muscle squelettique, mais également dans l'intestin de souris S.L.A.  et de cellules épithéliales intestinales humaines. De plus, les auteurs ont observé, qu’après un traitement avec du butyrate à 2% (un produit bactérien naturel capable de restaurer l'homéostasie microbienne intestinale), les souris G93A ont rétabli l'équilibre GM et l'intégrité de la barrière épithéliale intestinale, en plus d'avoir montré une amélioration des symptômes centraux et périphériques de la maladie, survie prolongée et ralentissement de la perte de poids (58). Ces données suggèrent que les changements de GM, la perméabilité intestinale altérée et l'inflammation entérique représentent l'un des premiers événements de la S.L.A. Cependant, ces résultats n'ont pas permis d'établir fermement si les altérations du réseau neuro-immunitaire des bactéries entériques contribuent à la physiopathologie de la S.L.A., ou si elles surviennent à la suite de la cascade d'événements accompagnant la neurodégénérescence (12).
Dans une étude récente, des souris SOD1-Tg sujettes à la S.L.A.  ont montré une dysbiose pré-symptomatique dépendante du vivarium et une modification de la configuration des métabolites, survenant avec une maladie aggravée dans des conditions de traitement antibiotique sans germes ou à large spectre (59). Les auteurs ont pu corréler certaines espèces du microbiote intestinal avec la sévérité de la S.L.A. et la supplémentation avec certaines espèces a changé le phénotype de souris (59). Dans ce contexte, la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) peut agir contre la progression de la S.L.A., par régulation de la signalisation mutuelle entre la microflore intestinale et le SNC (11), en utilisant une communication bidirectionnelle (via une signalisation neuronale, hormonale, immunologique et toxique) (14, 15). De plus, la communication directe par le nerf vague, les modifications du métabolisme du tryptophane et de la noradrénaline, la production et l'absorption de métabolites neuro actifs, l'activation immunitaire par mimétisme moléculaire et la production directe de neurotoxines (22) peuvent être utiles pour contrôler la S.L.A.) (13). Près de 30% des patients S.L.A.  présentent des dysfonctionnements autonomes avec une implication démontrée des colonnes intermédiaires et du noyau Onuf. Le nerf vagal pourrait être une voie pour la communication GM et cérébrale (60). Il est à noter que le GM interagit avec les voies nerveuses ENS-vague (61) parce que les neurotransmetteurs et les neuropeptides dérivés de bactéries peuvent activer directement les neurones myentériques, qui, à travers les fibres ascendantes des nerfs vagaux, fournissent des entrées nerveuses au cerveau (12, 62).
Les bactéries entériques et leurs métabolites (en particulier les AGCC) peuvent en effet induire les cellules entérochromaffines à libérer des neurotransmetteurs et des neuropeptides (y compris le peptide YY, le neuropeptide Y, la cholécystokinine, les peptides 1 et 2 de type glucagon et la substance P), qui à leur tour, peut atteindre le cerveau par la circulation sanguine et avoir un effet sur les fonctions du SNC (12). De plus, l'épithélium intestinal régule la propagation de produits bactériens spécifiques (p. Ex., AGCC, vitamines ou neurotransmetteurs, tels que l'acétylcholine, la dopamine, la noradrénaline, l'acide gamma-aminobutyrique ou la sérotonine) dans le système circulatoire, qui, à leur tour, peuvent arriver au CNS (11, 12). De cette manière, les métabolites, les neuropeptides et les neurotransmetteurs dérivés du microbiote en circulation peuvent pénétrer dans le SNC et ainsi influencer directement la neurobiologie et la pathologie de la S.L.A.
Les rapports de cas individuels de patients atteints de S.L.A.  ont documenté les bénéfices de la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) (63). Ce domaine de recherche est donc très innovant et suscite un intérêt croissant de la communauté scientifique internationale (13, 43).
Résultats attendus. Notre essai vise à évaluer les bases biologiques de la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) comme traitement potentiel de la S.L.A. afin de planifier une étude d'efficacité suivante sur la transplantation de microbiote fécal pour cette maladie.
Nous poursuivrons le premier essai clinique avec la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) chez les patients S.L.A. ; il s'agit d'une approche thérapeutique très innovante qui fournira des informations sur l'innocuité et la tolérabilité de la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL). Nous évaluerons les effets biologiques de la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) dans la S.L.A.  et nous disposerons de quelques données cliniques préliminaires sur la possibilité que les approches de traitement basées sur le microbiote puissent représenter une nouvelle cible thérapeutique pour la S.L.A. La force de notre étude est représentée par un large panel de tests biologiques visant à clarifier le rôle du réseau bactéries entériques-neuro-immunitaire chez les patients S.L.A.,  depuis les premiers stades de la maladie (les patients ne seront recrutés que si la maladie apparaît <18 mois ), en explorant les modèles immunologiques dans le sang, le LCR, la salive et les matières fécales, ainsi que le tissu de l'intestin grêle chez les patients atteints de S.L.A. traités ou non par T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL). Ces données seront corrélées avec la composition du microbiote salivaire, intestinal et fécal à différents moments, permettant de contribuer à la compréhension de la physiopathologie de la S.L.A. en termes d'implication du microbiote dans le processus causal de la S.L.A., ou comme conséquence des processus neurodégénératifs centraux.
De plus, un phénotypage clinique complet des patients sera réalisé selon le protocole de l'étude, permettant d'établir des corrélations entre des groupes précis de progression et le système GM, qui n'a jamais été exploré en termes de biomarqueur de progression de la maladie. Des analyses complémentaires portant sur des sous-groupes de patients sur la base de cellules Treg ou d'une population de microbiote permettront de mieux comprendre les pathos mécanismes sous-jacents de la maladie et de planifier des études avancées plus ciblées. L'échantillonnage à partir de différentes matrices donnera une vue complète des modifications opérées par la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) et à l'avenir, des bio matrices plus accessibles telles que la salive pourrait être envisagées pour surveiller l'état de la maladie chez les patients S.L.A. Cet essai a le potentiel de donner des résultats préliminaires pour mener d'autres études plus larges visant à évaluer l'efficacité de la T.M.F. (TRANSPLANTATION DE MICROBIOTE FÉCAL) dans le traitement de la S.L.A. Déclaration d'éthique. Cet ECR sera réalisé conformément à la Déclaration d'Helsinki, telle qu'amendée par la 64e Assemblée générale de l'AMM, Fortaleza, Brésil, octobre 2013, et aux directives actuelles de l'ICHGCP. L'étude a été approuvée par le comité d'éthique principal (Comitato Etico Area Vasta Emilia Nord en juillet 2018) et a été soumise aux comités d'éthique locaux. L'étude a obtenu l'approbation du Centre national de transplantation et du Conseil supérieur de la santé (en tant qu'autorités compétentes pour la transplantation expérimentale) en mars 2019. Tous les sujets, après des informations écrites et verbales complètes, dateront et signeront un formulaire de consentement éclairé approuvé (ICF) expliquant la justification, les procédures, la durée, les risques et les avantages possibles associés à l'étude. Le patient sera informé que la participation à l'étude est volontaire et que le refus de participer ou le retrait de l'étude, à tout moment, ne sera associé à aucune pénalité ou perte de bénéfices. Une compagnie d'assurance fournira une couverture d'assurance pour les dommages aux patients impliqués dans l'essai. Le chercheur principal recevra toutes les données concernant la compagnie d'assurance et le numéro de police. Enfin, la confidentialité et la confidentialité des données seront traitées conformément à la législation S.L.A. européenne et italienne. Un comité consultatif d'éthique indépendant (IEAB) a été créé pour répondre aux préoccupations d'éthique qui pourraient survenir au cours de l'étude, en se concentrant en particulier sur le formulaire de consentement éclairé. Pour cette raison, une fiche d'information patient sera remise au patient candidat au moins 15 jours avant la collecte de l'ICF. Dans la fiche d'information du patient, le patient trouvera un numéro de téléphone de l'IEAB qu'il pourra appeler pour avoir des informations indépendantes. De plus, lorsque le neurologue remettra la fiche d'information du patient au patient, l'investigateur informera l'IEAB d'une éventuelle inscription pour permettre au membre de l'IEAB d'être présent au moment de la collecte de l'ICF. Un comité indépendant de sécurité et de surveillance des données (DSMB) a également été créé pour répondre aux problèmes de sécurité et d'efficacité qui pourraient survenir au cours de l'étude. Les rapports comprenant toutes les données cliniques pertinentes des patients seront envoyés par l'Unité des Statistiques de l'Université de Modène au DSMB indépendant pour des réunions planifiées du DSMB lorsque 14 patients auront effectué le deuxième traitement et ensuite tous les 6 mois. Tous les partenaires garantiront la diffusion et l'exploitation des résultats scientifiques au sein du consortium et en externe (conférences internationales, publications, ateliers dédiés avec les patients). Les résultats seront présentés lors de réunions et ateliers nationaux et internationaux sur la neurologie et la S.L.A. Les résultats seront publiés sur www.clinicaltrials.gov et dans des revues internationales à comité de lecture.
Contributions d'auteur : AA, JM et LM ont contribué à la conception et à la conception de l'étude. RD'A a contribué à la conception de l'étude et a planifié l'analyse statistique. EZ et JM ont écrit la première ébauche du manuscrit. AA, EN, EZ, GC, LM, RD'A et TS ont rédigé des sections du manuscrit. Tous les auteurs ont contribué à la révision du manuscrit, lu et approuvé la version soumise. Le financement : Ce projet a été soutenu par le ministère italien de la Santé, Grant-No. RF-2016-02361616. Conflit d'intérêt. Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l'absence de toute relation commerciale ou financière pouvant être interprétée comme un conflit d'intérêts potentiel.
Remerciements : Les auteurs remercient le groupe de travail FETRALS (voir le groupe de travail FETRALS). 

[Admin]

Suite de la traduction en français : Les auteurs reconnaissent également la contribution des membres du Data Safety Monitoring Board indépendant (Prof. Josbert Keller, Dr. Ettore Beghi, Prof. Reetta Satokari) et du Independent Ethics Advisory Board (Prof. Antonio G. Spagnolo, Dr. Gabriele Semprebon). Groupe de travail FETRALS : Unité de Neurologie, Hôpital S. Agostino Estense, Département de Neurosciences, Azienda Ospedaliero Universitaria di Modena, Modène, Italie ; Département des sciences biomédicales, métaboliques et neurales, Université de Modène et Reggio Emilia, Modène, Italie : Jessica Mandrioli, Nicola Fini, Elisabetta Zucchi, Annalisa Gessani, Antonio Fasano, Ilaria Martinelli.
Laboratoire d'immunologie, Département de médecine expérimentale et clinique, Université de Florence, Florence, Italie : Amedeo Amedei, Elena Niccolai, Federica Ricci.
Scienze gastroenterologiche, endocrino-métaboliche e nefro-urologiche, Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS, Università Cattolica del Sacro Cuore, Rome, Italie ; Istituto di Medicina Interna e Geriatria, Università Cattolica del Sacro Cuore, Rome, Italie : Giovanni Cammarota, Antonio Gasbarrini. Instituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Rome, Italie Dipartimento di Scienze di Laboratorio ed Infettivologiche, Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS, Rome, Italie - Luca Masucci, Teresa Spanu, Gianluca Quaranta, Maurizio Sanguinetti.
Unité de statistique, Département des sciences médicales et chirurgicales pour enfants et adultes, Université de Modène et Reggio Emilia, Modène, Italie : Roberto D'Amico, Roberto Vicini.
Omnicentre neuromusculaire (NEMO), Fondazione Serena Onlus - Fondazione Policlinico A. Gemelli, Rome, Italie, & Institut de neurologie, Université catholique du Sacré-Cœur, Fondazione Policlinico A. Gemelli, Rome, Italie : Mario Sabatelli, Amelia Conte. Institut de Neurologie, Campus Policlinico Bio-Medico, Rome, Italie : Vincenzo di Lazzaro. Département des sciences neurologiques et psychiatriques (NEUROFARBA), Université de Florence, Florence, Italie, et hôpital universitaire de Careggi, unité de neurologie, Florence, Italie : Sabrina Mata, Sandro Sorbi. Clinique de neurologie, hôpital « S Annunziata », Chieti, Italie, et département de neurosciences et d'imagerie, université « G. d'Annunzio »de Chieti-Pescara, Chieti, Italie : Margherita Capasso, Marco Onofrj. Hôpital de Pérouse, Unité de Neurophysiopathologie, Azienda Ospedaliera di Perugia, S. Andrea delle Fratte, 06156 Pérouse, Italie : Teresa Anna Cantisani, Paola Brunori. Références. 1. Oskarsson B, Gendron TF, personnel NP. Sclérose latérale amyotrophique : une mise à jour pour 2018. Mayo Clin Proc. (2018) 93 : 1617–28. doi: 10.1016 / j.mayocp.2018.04.007. 2. Rossi S, Cozzolino M, Carrì MT. Mécanismes anciens ou nouveaux dans la pathogenèse de la S.L.A. Cerveau Pathol. (2016) 26 : 276–86. doi: 10.1111 / bpa.12355 ; 3. Geloso MC, Corvino V, Marchese E, Serrano A, Michetti F, D'Ambrosi N. Le double rôle de la microglie dans la S.L.A.  : mécanismes et approches thérapeutiques. Neurosci vieillissant avant. (2017) 9 : 242. doi: 10.3389 / fnagi.2017.00242 ; 4. Boillée S, Yamanaka K, Lobsiger CS, Copeland NG, Jenkins NA, Kassiotis G, et al. Début et progression de la S.L.A.  héréditaire déterminés par les motoneurones et la microglie. Science. (2006) 312 : 1389-192. doi: 10.1126 / science.1123511
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Mots clés : sclérose latérale amyotrophique, microbiote, immunité adaptative, transplantation de microbiote fécal, lymphocytes T, lymphocytes treg, essai clinique contrôlé randomisé.
Citation : Mandrioli J, Amedei A, Cammarota G, Niccolai E, Zucchi E, D'Amico R, Ricci F, Quaranta G, Spanu T et Masucci L (2019) FETR-ALS Study Protocol : A Randomized Clinical Trial of Fecal Microbiota Transplantation dans la sclérose latérale amyotrophique. De face. Neurol. 10 : 1021. doi: 10.3389 / fneur.2019.01021
Reçu : 8 mai 2019 ; Accepté : 9 septembre 2019;
Publié : 20 septembre 2019.
Édité par : Rosanna Cardani, Hôpital général de San Donato, Italie
Revue par : Paola Sandroni, Mayo Clinic, États-Unis
Raghav Govindarajan, Université du Missouri, États-Unis
Copyright :copyright: 2019 Mandrioli, Amedei, Cammarota, Niccolai, Zucchi, D'Amico, Ricci, Quaranta, Spanu et Masucci. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous les termes de la licence d'attribution Creative Commons (CC BY).

[Admin]

tRADUCTION EN ANGLAIS - STUDY PROTOCOL ARTICLE
Front. Neurol., 20 September 2019 | https://doi.org/10.3389/fneur.2019.01021
FETR-ALS Study Protocol: A Randomized Clinical Trial of Fecal Microbiota Transplantation in Amyotrophic Lateral Sclerosis
Jessica Mandrioli¹, Amedeo Amedei^2*, Giovanni Cammarota^3,4, Elena Niccolai², Elisabetta Zucchi^1,5, Roberto D'Amico⁶, Federica Ricci², Gianluca Quaranta^7,8, Teresa Spanu^7,8 and Luca Masucci^7,8 on behalf of The FETR-ALS Working Group
·        ¹Neurology Unit, Department of Neuroscience, S. Agostino Estense Hospital, Azienda Ospedaliero Universitaria di Modena, Modena, Italy
·        ²Laboratory of Immunology, Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, Florence, Italy
·        ³Scienze Gastroenterologiche, Endocrino-Metaboliche e Nefro-Urologiche, Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS, Università Cattolica del Sacro Cuore, Rome, Italy
·        ⁴Istituto di Medicina Interna e Geriatria, Università Cattolica del Sacro Cuore, Rome, Italy
·        ⁵Department of Biomedical, Metabolic and Neural Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Modena, Italy
·        ⁶Statistics Unit, Department of Medical and Surgical Sciences for Children & Adults, University of Modena and Reggio Emilia, Modena, Italy
·        ⁷Instituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Rome, Italy
·        ⁸Dipartimento di Scienze di Laboratorio ed Infettivologiche, Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS, Rome, Italy
Background and Rationale: Among the key players in the pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), microglia and T regulatory lymphocytes (Treg) are candidate cells for modifying the course of the disease. The gut microbiota (GM) acts by shaping immune tolerance and regulating the Treg number and suppressive function, besides circulating neuropeptides, and other immune cells that play in concert through the gut-brain axis. Previous mouse models have shown an altered enteric flora in early stage ALS, pointing to a possible GM role in ALS pathogenesis. Fecal Microbial Transplantation (FMT) is a well-known therapeutic intervention used to re-establish the proper microenvironment and to modulate enteric and systemic immunity.
Methods: We are going to perform a multicenter randomized double-blind clinical trial employing FMT as a therapeutic intervention for ALS patients (NCT0376632). Forty-two ALS patients, at an early stage, will be enrolled with a 2:1 allocation ratio (28 FMT-treated patients vs. 14 controls). Study duration will be 12 months per patient. Three endoscopic procedures for intestinal biopsies in FMT and control groups are predicted at baseline, month 6 and month 12; at baseline and at month 6 fresh feces from healthy donors will be infused at patients in the intervention arm. The primary outcome is a significant change in Treg number between FMT-treated patients and control arm from baseline to month 6. Secondary outcomes include specific biological aims, involving in-depth analysis of immune cells and inflammatory status changes, central and peripheral biomarkers of ALS, besides comprehensive analysis of the gut, saliva and fecal microbiota. Other secondary aims include validated clinical outcomes of ALS (survival, forced vital capacity, and modifications in ALSFRS-R), besides safety and quality of life.
Expected Results: We await FMT to increase Treg number and suppressive functionality, switching the immune system surrounding motorneurons to an anti-inflammatory, neuroprotective status. Extensive analysis on immune cell populations, cytokines levels, and microbiota (gut, fecal and saliva) will shed light on early processes possibly leading the degenerative ALS course.
Conclusions: This is the first trial with FMT as a potential intervention to modify immunological response to ALS and disease progression at an early stage.
Introduction
When questioning why so many failures in clinical trials in amyotrophic lateral sclerosis (ALS), the lack of a complete comprehension of the pathogenic systems behind the disease onset and progression might be accounted as one of the main reasons. Indeed, ALS is a complex syndrome. Aberrant cellular pathways convey from protein misfolding, with endoplasmic reticulum stress, defective autophagy and damage to cytoskeleton (1), associated to staggered RNA processing and mitochondria homeostasis, increased oxidative stress, enhanced excitotoxicity, reduced neurotrophic sustenance, and to a glial inflammatory response that is oriented toward a harmful side (2).
Recent studies highlighted the role of microglia and opened new perspectives in the knowledge of the non-cell autonomous molecular mechanisms possibly contributing to ALS, launching them as a plausible target for many clinical trials. During ALS progression, activated microglia switch from the M2 phenotype, which is neuroprotective and supports tissue repair and neuron survival through the release of neuroprotective factors, to M1 phenotype, which is toxic and contributes to neuronal death through pro-inflammatory cytokines production, and tissue destruction. Therapeutic approaches targeting microglia polarization to induce the M2 phenotype are promising strategies to contain local neurodegeneration and improve ALS outcome (3). Indeed, in animal models of the disease, diminishing the mutant levels of microglia sharply slowed later disease progression (4).
M1/M2 macrophages phenotypes switch have been shown to be induced by CD4⁺ T cells, especially CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ T regulatory (Treg) cells (5, 6). In the blood and spinal cord of patients with ALS, CD4⁺ T cells (T helper—Th) are increased, especially with a predominantly pro-inflammatory Th1/Th17 phenotype (7). On the contrary, Tregs from blood of ALS patients demonstrated a significant decrease in the ability to suppress the proliferation of the effector T cells; and of note, the loss extent in suppression was correlated with disease progression (7). The passive transfer of mSOD1 Tregs into ALS mice lacking functional T lymphocytes prolonged their survival while FoxP3 mRNA in the spinal cord of mSOD1 mice inversely correlated with disease progression (8). Finally, in ALS patients the Tregs' number and percentage, and FoxP3 expression decreased with faster disease progression and were early predictors of ALS progression and survival (8, 9).
Very recently, autologous infusions of expanded Treg cells and concomitant IL-2 into patients with ALS resulted to be safe and tolerable during early and later stages of disease in a phase I study, where infusions seemed to slow progression rates (10). Moreover, the study detected a correlation between Treg suppressive function and disease progression, underscoring the rationale underlying the use of Treg suppressive functionality as an indicator of clinical status (10).
All these evidences convey toward a dysfunction of the adaptive immune response during ALS. Increasing data suggest that the systemic immune response and especially the neuroimmune system can be modulated by gut microbiota (GM) through the gut-brain axis, a key player in the regulation of mutual signaling between gut microflora and central nervous system (CNS) (11, 12) employing bidirectional communication via neuronal, hormonal, immunologic, and toxic signaling (13–15).
Intestinal microbiota includes a complex ecosystem with an exceptionally high bacterial density and diversity: the adult alimentary tract contains 1–2 kg of microbial cells of hundred bacterial species, of which over 80% have not been cultured (16–18).
GM communicates straightforward with the enteric immune system, shaping immune tolerance and thus contributing to the modulation of immune reactions during inflammation (19). Conversely, upon pathogen invasion, dysbiosis or barrier break, the microbe-associated molecular patterns stimulate macrophages and dendritic cells to produce pro-inflammatory cytokines. In turn, the cytokine activate the adaptive immune cells, thus contributing to the breakdown of immune homeostasis (20), and typically, determines loss of the immune cells that keep the aggressiveness of the immune system in check, namely Tregs (12).
Several brain biological processes may be influenced by GM alterations. Germ free mice have been found to have an altered density, morphology and maturity of microglia, and treatment with a short chain fatty acids (SCFA) mixture restored the density and morphology of CNS immune cells, suggesting that GM can influence both the development and functions of microglia (12, 21).
In ALS, GM dysbiosis may facilitate the disease onset or drive its progression and related outcomes, in the presence of other risk factors. Alternately, the GM dysbiosis may be (further) altered by the disease presence and in some individuals contribute to disease progression, prognosis, also in terms of variable response to drug treatments (22).
An alteration in the intestinal bacterial flora as an external trigger could explain the rare cases of ALS in spouses or in some clusters (23).
Based on these premises, to treat GM dysbiosis through microbiota restoration would have the potential to interfere and slow ALS progression (24).
Our trial aims at evaluating the biological basis of a potential treatment for ALS (namely fecal microbiota transplantation, FMT) in order to plan a following efficacy study.
The primary objective is to evaluate if FMT augments Tregs' number in ALS patients, treated with FMT compared to the control arm and measured at baseline and at month 6.
The secondary objectives include specific biological aims: (i) comparison between treated patients and control arm of Tregs'number and T cell subsets at different time points in blood and gut tissue samples; (ii) comparison between treated patients and control arm of neurophylaments and CSF cytokines and cells; (iii) analysis of fecal and saliva samples between the two groups to evaluate microbiota and cytokines' profile; (iv) FMT safety and tolerability in ALS; (v) clinical assessment (including tracheostomy-free survival, Forced vital capacity score, ALSFRS-R score, frequency of PEG or NIV); finally, (vi) the Quality of Life (QoL) assessment.
Methods and Analysis
Study Design
We are going to perform a randomized double blind multi-center study on FMT in ALS.
The Figure 1 summarizes the study design.
FIGURE 1

Figure 1. Picture of the study design.
The study will include 42 ALS patients with 2:1 allocation in 2 groups of subjects (28 FMT vs. 14 controls). Patients will be screened in the 15 days before baseline; then they will be randomly allocated to either FMT or control group. Randomization will be 2:1 (FMT: controls) and will be performed on line (using a computer-generated list of random number that will be centrally generated in the Statistical Unit). Given the heterogeneous ALS progression, patients will be stratified by ΔFS (progression rate), calculated at randomization according to Kimura et al. (25). Riluzole will be maintained during the entire study duration unless adverse events or patients' decision to withdraw. Endoscopic treatment will be performed within 21 days from randomization. Randomization number will not be re-used in any case. Estimated enrolment time is 18 months.
Study Population
The study will include probable laboratory-supported, clinically probable, or definite ALS according to revised El Escorial criteria (sporadic and familiar). Inclusion and exclusion criteria for the enrolment of the patients are presented in the Table 1.
TABLE 1

Table 1. Inclusion and exclusion criteria for patients.
Interventional Methods
Treatment will be double blinded to patients and neurologists, but not to the endoscopist and microbiologist. ALS patients will undergo upper GI endoscopy with small-intestine biopsies (n° 4 biopsies of small intestine, performed with a standard biopsy forces) at baseline and after 6 and 12 months. At baseline, the patients will be randomized (2:1) to either an allogenic (from donors) infusion of collected feces (60 grams) (FMT) in the duodenum-jejunum or no treatment (control group). The infusion will be performed through a standard nasojejunal tube that will be placed during endoscopy. Fecal infusion will be repeated at month 6. Control group patients will not receive any treatment (at baseline or at month 6), but will remain blind to treatment because of sedation due to small-intestine biopsies. Fecal microbiome will be diluted in saline solution (200 ml) and infused at 30 ml/min speed (whole amount of the performance: 15 min). Fresh feces for the FMT will be obtained by habitual healthy donors for Clostridium difficile infection. The Table 2 shows the blood and stool testing for donators and the general selection criteria. Before preparation, sample donation will be always analyzed by rapid molecular test to detect intestinal pathogens.
TABLE 2

Table 2. Criteria for donors' selection.
Analysis of T cell sub-populations will be performed both in peripheral blood and gut mucosa: Treg, Th17 cells, effector, and central memory cells.
At the end of the treatment period, further 6 months will be required as a follow-up period. This time is intended to assess late adverse events (AEs) and later biological or clinical effects of transplantation.
Sample Size Estimation
Sample size was calculated considering as primary outcome measure the proportion of patients, in the transplantation group with respect to controls, displaying a “positive response” intended as an increase in the proportion of Treg by at least 20%. The null hypothesis states that FMT does not ameliorate significantly the proportion of positive responses in treated patients after the second FMT round, compared to their baseline and to control group. The alternative hypothesis is that FMT gives a proportion of positive responses in at least 50% of treated patients compared to a maximum 5% of positive responses in patients of the control group. The study was designed to refuse the null hypothesis with an alpha error of 0.05 and a power of 0.80 according to previously published statistical methods (26) and to known levels of Tregs in ALS patients, that typically display a slight reduction of Treg % (mean ± standard deviation: 2.1 ± 0.7) with respect to healthy controls with fast progressors patients having on average 31% fewer Treg (8, 27).
For this purpose, a population of 39 patients randomized in two treatment arms would suffice; taking into account an average drop out of 10%, a recruitment of 42 patients will be needed.
Outcome Measures
Primary outcome measure is the modification from baseline to month 6 in Treg number in transplanted ALS patients compared to the control arm (26).
Secondary outcome measures include the following:
✓ Biological outcome measures:
– Change from baseline to month 3, 6, 9, 12 of the T cell distribution especially the ratio Treg/Th1 or Treg/Th17 comparing FMT arm and control arm (both blood—at each time point, and small intestine—only at 6 and 12).
– Changes from baseline to month 3, 6, 9, 12 in inflammatory status (cytokine profile) comparing FMT and control arm (in blood and feces at each time point, and in CSF at month 6).
– Changes from baseline to month 3, 6, 9, 12 between FMT arm and control arm in the following biomarkers: creatinine, albumin, CK, vitamin D, plasma/CSF neurofilament heavy/light chain protein.
– Biological modifications from baseline to month 6 and 12 in the composition of saliva, gut and fecal microbiota (including SCFA) comparing FMT and control arm.
✓ Safety: will be assessed in FMT and control arm considering the occurrence of AEs and modifications in physical examination, vital signs, body weight, and laboratory tests (biochemistry, hematology) during and following the treatment.
✓ Clinical outcome measures:
The following clinical variables will be compared between FMT and control arm:– Change from baseline to each time point (month 1, 3, 6, 9, 12) of ALSFRS-R.
– Survival from onset and randomization to death or tracheotomy.
– Change of Forced Vital Capacity (FVC) from baseline to each time point (month 1, 3, 6, 9, 12).
– Frequency of procedures (PEG, NIV, IV) from baseline to month 3, 6, 9, 12.
✓ Quality of life: will be assessed as the change in absolute and relative values of the Amyotrophic Lateral Sclerosis Specific Assessment Questionnaire (ALSAQ40) from baseline to month 6 and 12 in FMT and control arm.
The Table 3 shows the study flow chart.
TABLE 3 Adverse Events and Safety
According to Directive 2004/23/EC (implemented in Italy with D.Lgs 191/2007):
– “Serious adverse event” (SAE) means any untoward occurrence associated with the procurement, testing, processing, storage, and distribution of tissues and cells that might lead to the transmission of a communicable disease, to death or life-threatening, disabling, or incapacitating conditions for patients or which might result in, or prolong, hospitalization, or morbidity (https://www.hta.gov.uk/policies/human-application-adverse-event-and-reaction-saears-reporting; http://www.sc-toolkit.ac.uk/displaycontent.cfm?widCall1=customWidgets.content_view_1&cit_id=84).
– “Serious adverse reaction” (SAR) means an unintended response, including a communicable disease, in the donor or in the recipient associated with the procurement or human application of tissues and cells that is fatal, life-threatening, disabling, incapacitating, or which results in, or prolongs, hospitalization or morbidity (https://www.hta.gov.uk/policies/human-application-adverse-event-and-reaction-saears-reporting; http://www.sc-toolkit.ac.uk/displaycontent.cfm?widCall1=customWidgets.content_view_1&cit_id=84).
The existing studies suggest that FMT is a safe therapy, with few serious adverse events reported. There have been individual reports of peripheral neuropathy, Sjogren syndrome, idiopathic thrombocytopenic purpura, microscopic colitis, contact dermatitis, rheumatoid arthritis, obesity, bacteremia, and ulcerative colitis flare after FMT (24). In one meta-analysis, the overall incidence rate of adverse events after FMT was 28.5%. The commonest FMT-attributable adverse event was abdominal discomfort; also diarrhea, transient fever, nausea, vomiting, and constipation were other common symptoms associated to FMT (24, 28–31).
For these mild adverse events, investigators will treat symptoms according to the usual clinical practice. In case of symptoms that could be considered severe or life threating, the investigator will have to inform the sponsor immediately (within 24 h by fax using a SAE form) and second FMT round may be avoided accordingly to the local investigator's judgment. In accordance with the legiS.L.A. tive requirements, Centers will be requested to report immediately from their awareness any SAE or SAR occurring during the trial and coordinating center will send Completed forms by email to Italian National Transplantation Center (CNT).
The coordinating Center will be responsible for appropriate AE reporting to the regulatory authorities (CNT) every 6 months; investigators will be responsible for reporting to appropriate Ethic Committee. In case of death, a clinical report will be prepared by the caring investigator together with SAE form; in case of autopsy, autopsy report will be added to study documentation.
The trial will be stopped in case of 30% excess in the treating group of the following AEs: peritonitis, upper gastrointestinal hemorrhage, sepsis, bacteremia. Instead, the next toxicities will be considered acceptable: diarrhea, abdominal cramping and pain, nausea, vomiting, flatulence, fever, constipation, dizziness, sore throat, rhinorrhea, bloating, nasal stuffiness, urinary infections, headache, mild/moderate blood cells alterations; elevated CRP, rashes, urticaria, dermatoses, dermatitis (mild/moderate severity), elevated aminotransferase/alkaline phosphatase, loss of appetite, colitis/gastroenteritis.
Data Recording and Data Monitoring
An electronic case report form (CRF) will be prepared for data recording.
A certified contract research organization (CRO) will be in charge for monitoring the study.
The study monitor indicated by the coordinating center will be in contact with the investigators and will conduct a visit to each Center to discuss and/or collect data. The Monitor will conduct a visit before the start of the study to discuss the protocol and obligations of the investigators and sponsor. Investigators of each center are required to allow the Monitor to conduct the site visit, the study-end visit and the site closure visit.
The Investigators will make all pertinent records available including original medical documents for inspection by regulatory authorities.
Copies of the protocol, subject identification codes, electronic Case Report Form, source data, Informed Consent Form and other documents related to the study conduction and support the data collected from each subject will be stored for the maximum period of time as required by the study centers. No study document should be destroyed.
Originals of all documentation and copies of outgoing correspondence concerning the study will be stored and retained by the Sponsor in a safe area in the Trial Master File.
Role of Participating Centers
This multicenter study will involve nine Italian Units: six referral ALS Centers (located in Florence, Chieti, Perugia, Modena, and Rome), three renowned laboratories, one endoscopy service and a statistical unit.
ALS is a rare disease with fast progression and no effective treatment, which requires a solid methodological, clinical approach, and biological background for clinical trials conduction.
Each clinical center is expected: (I) to randomize at least seven patients according to including and excluding criteria in 18 months; (II) to provide one principal investigator to evaluate including and excluding criteria, and assess primary and secondary outcomes; (III) to adhere to ALS management guidelines of the European Federation of Neurological Societies(in particular as regards ventilation and nutrition issues).
The analysis of biomarkers will be centralized and performed in two internationally renowned laboratories Laboratory of Microbiology Policlinico Gemelli in Rome and Laboratory of Immunology, Department of Experimental and Clinical Medicine—University of Florence, and FMT will be performed at Policlinico Gemelli in Rome, a leading European Center for this kind of treatment.
Data Analysis
Data will be collected by investigators through electronic CRF, which will be conveyed to the trial database. At trial completion, data from the locked database will be extracted for analysis by an expert statistician.
Separate analyses will be performed in:
1. All randomized subjects receiving at least 1 FMT (Intention-to-treat population).
2. All randomized subjects excluding protocol deviations (Per protocol population).
As far as biological activity is concerned, immune response to FMT will be analyzed as a difference in positive response to FMT between the control group and the FMT group, assessed by comparison of proportion of patients in the two groups showing a mean Tregs increase by at least 20%, between baseline and month 6 measurements.
Mean values of different T, B, NK cell subpopulations, neurodegeneration biomarkers, and cytokines will be assessed and mean differences in plasma concentrations between the two treatment arms will be calculated using t-test or Wilcoxon-Mann-Whitney test as previously reported (26). ANOVA will be used for assessing the mean change over time for the same variables as above, with treatment as between-subjects factor and time as within-subjects factor. Different models will be used, each with a different biomarker of activity as the dependent variable. Models will be adjusted for any unbalanced distribution of the main prognostic factors (e.g., age) between the two treatment arms, according to previously published statistical methods (26).
Analysis of microbiota will be performed with specific software.
Record of any AE and SAE will be kept for every subject receiving at least one round of FMT till the study completion, performing safety analysis accordingly.
As for clinical outcome measures, we will compare ALSFRS-R total score and subscores (bulbar, respiratory, gross, and fine motor) changes from baseline to each time point in treatment arm vs. control arm. Frequency of procedures (PEG, NIV, IV) will be compared from baseline to each time point in treatment vs. control arm. The comparison of clinical endpoint among arms will be carried out by using the logistic regression model. Results will be presented as odds ratios (OR) and 95%C.I. FMT will be considered effective in relation to controls whether the OR of positive results will provide a p < 0.05. Change in FVC during the study will be analyzed using a mixed model for repeated measures (MMRM). Difference between treatment groups and two-sided 95% CI will be estimated .Log-rank tests via Kaplan-Meier method will be employed to compare differences in tracheostomy-free survival between the two treatment arms (from onset and from randomization), while Cox's proportional hazard model will be used for adjusting for any possible unbalanced prognostic factors. Statistical significance will be set at 0.05 level for a two-tailed test. Last observation will be considered for patients with missing data.
Given the short duration of the study, an interim analysis of efficacy data is not scheduled. Nevertheless, to address safety concerns, a report including all relevant clinical data of patients will be sent by the Statistics Unit to an independent Data and Safety Monitoring Board for scheduled DSMB meetings (also through Skype) when 14 patients would have completed the second treatment and then every 6 months.
Ethics Approval
This study has been approved by Comitato Etico Area Vasta Emilia Nord on July 2018 (prot. n. 0010722/18), and by National Transplantation Center on 29 March 2019.
The trials has been registered in clinicaltrials.gov (NCT03766321).
Discussion
Choice of Treatment
FMT dates back to fourth-century China, as a report of a traditional Chinese medicine doctor describing a patient's recovery from food poisoning and severe diarrhea after treatment with oral human fecal suspension (32). Further uses of this kind of treatment have been described since the sixteenth century (32–35) mainly through retention enema.
More recently, FMT has emerged as a safe and effective treatment for the management of recurrent, and possibly refractory, Clostridium Difficile Infection (CDI) by restoring gut microbial diversity, with cure rates >85% (36). Currently, the FMT has been approved for the treatment of this condition, for which it has had unanimously excellent results (24, 37, 38).
Since a perturbed microbiota is associated with several diseases, it is conceivable that microbiota restoration therapies could be useful in their management (24). The importance of “healthy” gut microbiome has been shown in oncology, an in detail in relation to response to antitumor treatment (39–41). In addition, a few papers have recently highlighted a potential link of gut dysbiosis and neurological diseases (41–45), such as multiple sclerosis (46, 47), Parkinson's Disease (48, 49), and Alzheimer's disease (50, 51).
For this reason, there are studies now testing FMT potentiality to treat multiple sclerosis, myasthenia gravis, Parkinson's Disease, and epilepsy (22, 52).
Some preliminary data place the theoretical basis for a GM involvement in ALS because immune system, which plays a key role at least in ALS progression, can be modulated through gut-brain axis. Indeed, the gut environment favors the generation of autoreactive T-cells with unique regulatory functions, important for preventing CNS autoimmunity (53). Some commensal bacteria can induce Tregs development and FMT determine Tregs' increase (54).
Moreover, alterations in GM composition in ALS have been reported in previous studies. Fang et al. (55) found a significantly increased population of harmful microorganisms (genus Dorea) with reduced population of beneficial microorganisms (genus Oscillibacter, Anaerostipes, Lachnospiraceae) in ALS patients (45). The authors suggested that the imbalance in intestinal microflora constitution may cause a pro-inflammatory dysbiosis that may alter the intestinal epithelial barrier, promoting immune/inflammatory responses with a major role in ALS pathogenesis.
Another study (56) detected a higher amount of E. Coli and Enterobacteria and a low presence of total yeast in the GM composition of ALS patients with respect to healthy controls.
Two pre-clinical researches, performed in G93A animals, studied the correlation between gut dysbiosis, altered intestinal permeability and enteric inflammatory/neurogenic responses (12). Wu et al. (57) found signs of leaky intestine in a G93A transgenic mouse having an augmented gut permeability due to impairment of the intestinal tight junction structure and related protein expression, if compared to wild-type mice (57). The same model showed a reduced number of and an altered function of epithelial Paneth cells, that impact the GM and have a role in the innate immune response, and, as far as concerns GM composition, a lower abundance of butyrate-producing bacteria such as Butyrivibrio fibrisolvens, Escherichia coli, and Firmicutes was detected. Finally, shifts in the gut microbiome included.
Likewise, Zhang et al. (58) reported a correlation between gut dysbiosis and morphofunctional alterations of intestinal permeability in the same model, since the earliest stages of the disease. They demonstrated the presence of SOD1 aggregates, which are distinctive of ALS associated to SOD1 mutations in animal models and in patients, not only in neurons and skeletal muscle, but also in the intestine of ALS mice and human intestinal epithelial cells. Moreover, the authors observed that, following treatment with 2% butyrate (a natural bacterial product able to restore the intestinal microbial homeostasis), G93A mice restored GM balance and intestinal epithelial barrier integrity, besides they showed improved central and peripheral symptoms of the disease, prolonged survival, and slowing of weight loss (58).
These data suggested that changes in GM, impaired intestinal permeability and enteric inflammation represent one of the earliest events in ALS. However, these findings did not allow to firmly establish whether the alterations of the enteric bacteria neuro-immune network contribute to the ALS pathophysiology, or whether they happen as a consequence of the cascade of events accompanying neurodegeneration (12).
In a recent study, SOD1-Tg mice prone to ALS showed a vivarium-dependent pre-symptomatic dysbiosis and an altered configuration of metabolites, occurring with a disease worsened under conditions of germ-free or broad-spectrum antibiotic treatment (59). The authors could correlate some species in gut microbiota with ALS severity and supplementation with certain species changed mice phenotype (59).
In this context, FMT may act against ALS progression, by regulation of the mutual signaling between gut microflora and CNS (11), employing bidirectional communication (via neuronal, hormonal, immunologic, and toxic signaling) (14, 15). Moreover, direct communication through the vagus nerve, changes in tryptophan and norepinephrine metabolism, production and absorption of neuroactive metabolites, immune activation through molecular mimicry and the direct production of neurotoxins (22) may be useful in controlling ALS disease) (13). Nearly 30% of ALS patients show autonomic dysfunctions with demonstrated involvement of the intermediolateral columns and the Onuf nucleus. The vagal nerve could be a route for GM and brain communication (60). Of note, GM has been found to interact with ENS-vagus nerve pathways (61) because, bacterial derived-neurotransmitters and neuropeptides can activate directly myenteric neurons, which, through vagal nerve ascending fibers, deliver nerve inputs to the brain (12, 62).
Enteric bacteria and their metabolites (especially the SCFAs) can indeed induce enterochromaffin cells to release neurotransmitters and neuropeptides (including peptide YY, neuropeptide Y, cholecystokinin, glucagon-like peptide-1 and−2, and substance P), which, in turn, can reach the brain through blood circulation and have an effect on CNS functions (12). In addition, the intestinal epithelium regulates the spread of specific bacterial products (e.g., SCFAs, vitamins or neurotransmitters, such as acetylcholine, dopamine, noradrenaline, gamma-aminobutyric acid, or serotonin) into the circulatory system, that, in turn, may arrive to the CNS (11, 12). In this way, circulating microbiota-derived metabolites, neuropeptides, and neurotransmitters can enter the CNS and so directly influence the neurobiology and the ALS pathology.
Individual case reports of ALS patients documented benefits as a result of FMT (63). This research field is therefore highly innovative and is gathering increasing interest from the international scientific community (13, 43).
Anticipated Results
Our trial aims at evaluating the biological bases of FMT as a potential treatment for ALS in order to plan a following efficacy study on fecal microbiota transplantation for this disease.
We will carry on the first clinical trial with FMT in ALS patients; this is a highly innovative therapeutic approach that will give information about safety and tolerability of FMT. We will assess biological FMT effects in ALS and we will have some preliminary clinical data about the possibility that microbiota-based treatment approaches can represent a new therapeutic target for ALS.
The strength of our study is represented by a large panel of biological tests aimed at clarifying the role of enteric bacteria-neuro-immune network in ALS patients, since the earlier stages of the disease (patients will be enrolled only if disease onset <18 months), through exploration of immunological patterns in blood, CSF, saliva, and feces, along with small intestine tissue in ALS patients treated or not with FMT. These data will be correlated with composition of saliva, gut and fecal microbiota at different time points, allowing to contribute to the understanding of ALS pathophysiology in terms of microbiota involvement in the causal ALS process, or as a consequence of the central neurodegenerative processes.
Moreover, comprehensive patients' clinical phenotyping will be accomplished according to the study protocol, allowing to establish correlations between precise groups of progressors and the GM system, which has never been explored in terms of biomarker of disease progression. Further analyses considering subgroups of patients on the basis of Treg cells or microbiota population will help to better understand underlying pathomechanisms of the disease and to plan more targeted advanced studies.
The sampling from different matrices will grant a full view of the modifications operated by FMT and in the future, more accessible biomatrices such as saliva might be considered for monitoring disease status in ALS patients. This trial has the potential to give preliminary results to carry on further larger studies aimed at assessing FMT effectiveness in ALS treatment.
Ethics Statement
This RCT will be performed in compliance with the Declaration of Helsinki, as amended by the 64th WMA General Assembly, Fortaleza, Brazil, October 2013, and with the current ICHGCP-guidelines.
The study has been approved by lead ethics committee (Comitato Etico Area Vasta Emilia Nord on July 2018) and has been submitted to local ethics committees. The study obtained the approval of National Transplantation Center and Superior Council of Health (as competent authorities for experimental transplantation) on March 2019.
All subjects, after comprehensive written and verbal information, will date and sign an approved Informed Consent Form (ICF) explaining rationale, procedures, duration, possible risks and benefits associated with the study. The patient will be informed that participation in the study is voluntary and that refusal to participate or withdrawal from the study, at any time, will not be associated to any penalty, or loss of benefits. An insurance company will provide insurance coverage for damages to patients involved in the trial. Principal Investigator will be supplied with all data concerning the insurance company and policy number. Finally, the data privacy and confidentiality will be treated according to European and Italian law. An Independent Ethics Advisory Board (IEAB) has been established, to address ethics concerns that could arise during the study, focusing especially to informed consent form. For this reason patient information sheet will be given to the candidate patient at least 15 days before the collection of the ICF. In the patient information sheet the patient will find a telephone number of the IEAB that he/she could call to have independent information. Furthermore, when the neurologist will give the patient information sheet to the patient, the investigator will advise IEAB of a possible enrollment to allow IEAB member to be present at the moment of the ICF collection. An independent Data Safety and Monitoring Board (DSMB) has been established too, to address safety and efficacy concerns that could arise during the study. Reports including all relevant clinical data of patients will be sent by the Statistics Unit of the University of Modena to the independent DSMB for scheduled DSMB meetings when 14 patients have done the second treatment and subsequently after every 6 months. All the partners will guarantee the dissemination and exploitation of the scientific results within the consortium and externally (international conferences, publications, dedicated workshops with patients). The results will be presented during national and international neurological and ALS meetings and workshops. Results will be published on www.clinicaltrials.gov and in peer-reviewed international journals.

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